药用植物大规模组织培养

前  言
药用植物的大规模组织培养对我国具有非常重要的意义，因为我国是世界上使用和出口药用植物最多的国家，大规模组织培养技术可以为部分解决我国中药的资源替代问题提供一条有效的途径。药用植物的组织培养，一方面可以直接生产次生代谢物，如紫草素、紫杉醇、长春新碱的生产等；另一方面可以生产替代资源，如用组织培养生产的高丽参不定根已经开发成功了一系列功能食品和化妆品，利用虫草的菌丝发酵物已经生产了大量的保健品等。此外，还可以与GAP栽培相结合，如石斛、降香、太子参、金线莲等，组织培养技术已经是这些药用植物GAP栽培不可缺少的技术环节。因此，本书的出版既有重要的理论意义，又有重要的实用价值。
从现有的组织培养方面的图书来看，大规模培养的内容很少，本书的出版，将弥补此方面的空白。本书编写时在内容和格式上均不同于以往的相关图书，突出了大规模培养的特点。在理论上力求反应本领域的国际前言，引用了大量的国内外资料；在内容上既有药用植物组织培养的内容，还有反应器的设计与使用以及针对组织培养物进行分析的内容。在组织培养的内容中既叙述了次生代谢调控的基础理论，又介绍了大规模工业化培养的具体实例；在详细介绍了药用植物细胞培养的同时，又突出了药用植物器官培养的优势；既有药用植物普通细胞和器官的培养，又有转基因组织和器官的培养。内容丰富详实，新颖全面。本书的读者对象可以是院校和科研院所的工作人员，也可以是相关企业和GAP基地的工作人员；本书既适合于从事中药和药用植物的专业人员，也适合于从事生物学、植物学和天然产物专业的工作人员。
在本书的编写过程中，各位编委努力工作，精诚合作。第一章和第八章由高文远和贾伟共同完成；第二章由邱德有完成；第三章和第五章由黄璐琦、陈美兰、陈巍共同完成；第四章由刘明言、周杰共同完成；第六章由郭肖红、陈巍、陈海霞共同完成；第七章由宋经元、陈士林和马小军共同完成；第九章由段宏泉、张铁军共同完成；附录由郭肖红完成。
本书的编写过程中，引用了大量国内外公开发表的学术论文，在此对这些原文作者致以诚挚的谢意。感谢恩师肖培根院士多年的鼓励和培养，并在百忙中为本书作序；感谢博士后导师韩国忠北大学的KEE-YOEUP PAEK教授和香港生物技术研究院的藤惠兰博士，他们提供了让我从事药用植物大规模培养的机会。
由于时间仓促及水平有限，书中一定有许多不尽如人意的地方，虚心接受读者的批评和指正，使本书再版时可以进一步完善和提高。

作为中药生物工程的核心内容之一，药用植物组织培养技术在药用植物的资源保护和可持续利用方面可以发挥重要的作用。
本书的内容定位在药用植物“大规模”培养的基点上，对反应器的应用作了专门的阐述，重点介绍了反应器的构造原理、操作特点及选用依据，结合具体实例对最近十多年来国内外药用植物大规模培养所取得的诸多成就进行了总结。
本书对从事中药生物工程事业的人有一定的参考价值，也可供从事中药、化妆品、保健品生产及相关专业领域的技术人员参考。

第一章 概论1
 第一节 药用植物对人类的贡献1
 第二节 生物技术应用的意义3
 第三节 植物细胞培养生产药用次生代谢产物4
 第四节 促进药用植物细胞培养生产次生代谢产物的措施和技术8
 一、筛选高含量的细胞系8
 二、用培养液的调整来促进目的产物的合成9
 三、优化培养环境和培养条件11
 四、诱导子的作用（elicitation) 12
 五、渗透处理13
 六、产品的原地转移13
 七、β-环糊精的应用14
 第五节 植物器官培养生产药用次生代谢产物14
 第六节 毛状根培养生产药用次生代谢产物15
 第七节 药用植物固定化细胞培养生产次生代谢产物17
 第八节 生物转化法用于次生代谢物的生产19
 第九节 药用植物细胞的大规模培养21
 第十节 我国药用植物组织培养的发展与策略22
 一、我国药用植物组织培养的发展22
 二、我国药用植物组织培养的策略分析23
 主要参考文献27
第二章 药用植物克隆培养中活性成分合成及其调控31
 第一节 国内外现状，意义31
 一、国内外现状31
 二、研究意义32
 第二节 基本理论和基本方法33
 一、药用植物克隆培养中活性成分生物合成途径的研究33
 二、参与生物合成相关酶的提取分离、纯化及性质分析35
 三、生物合成相关基因的克隆、分离及表达特性的研究35
 四、生物合成调控的研究43
 第三节 活性成分代谢与调控研究的实例47
 第四节 活性成分合成与调控研究的热点领域56
 一、活性成分的贮存56
 二、活性成分的运输57
 三、活性成分的降解58
 第五节 存在问题及展望58
 主要参考文献59
第三章 药用植物组织培养的基本方法63
 第一节 药用植物组织培养的基本设备及技术63
 一、基本设备63
 二、基本操作技术69
 第二节 药用植物组织培养的技术与方法82
 一、药用植物组织培养的基本技术和方法82
 二、外植体的接种91
 三、影响药用植物组织培养的因素91
 四、增加药用植物组织培养物中活性成分的方法93
 主要参考文献96
第四章 反应器在药用植物大规模培养中的应用98
 第一节 反应器应用的必要性99
 第二节 反应器的理论基础100
 一、反应器的分类100
 二、反应器的体积101
 三、植物细胞、组织或器官培养用反应器106
 四、培养介质的流变学特性108
 五、反应器内的多相流动形态及培养液性质109
 六、反应器内的质量传递110
 七、反应器内的热量传递113
 八、反应器内存在的剪切应力问题114
 九、反应器流动模型117
 十、反应器的放大120
 十一、过程参数检测与控制126
 第三节 反应器的种类及选择130
 一、植物细胞培养的特点130
 二、反应器的设计基本要求130
 三、用于植物细胞培养的反应器131
 四、各类反应器131
 五、反应器的比较与选择144
 六、植物组织培养及反应器145
 七、反应器的放大145
 主要参考文献146
第五章 药用植物的细胞培养及工业化生产147
 第一节 药用植物的细胞培养147
 一、单细胞的分离148
 二、单细胞培养的方法149
 三、单细胞的培养条件150
 四、高产细胞系的诱导和筛选151
 第二节 药用植物愈伤组织的诱导与培养152
 一、愈伤组织的诱导以及影响因素153
 二、愈伤组织的生长155
 三、愈伤组织发生的形态学和细胞学156
 第三节 细胞悬浮培养157
 一、培养系统157
 二、悬浮细胞培养周期159
 三、细胞培养的基本程序159
 四、培养设备和装置160
 五、悬浮培养细胞的同步化162
 六、悬浮细胞培养中细胞生长的计算163
 七、影响细胞分散度的因素以及提高细胞分散度的方法164
 八、影响悬浮细胞培养的因素165
 第四节 药用植物细胞培养的工业化生产167
 一、人参细胞悬浮培养及工业化生产人参皂苷168
 二、紫草的细胞培养与工厂化生产紫草素172
 主要参考文献174
第六章 药用植物的组织和器官培养176
 第一节 药用植物组织和器官培养的意义176
 第二节 药用植物的快速繁殖176
 第三节 药用植物的愈伤组织培养和植物再生181
 第四节 药用植物的体细胞胚胎发生和植株再生185
 第五节 药用植物的原生质体培养189
 第六节 药用植物的花药培养195
 第七节 药用植物的人工种子197
 主要参考文献199
第七章 药用植物转基因组织和器官培养203
 第一节 药用植物转基因组织和器官培养的研究进展与发展前景203
 一、研究历史、存在的问题、发展前景203
 二、转化机理与培养特点204
 三、转基因组织和器官培养的应用205
 四、转基因组织和器官的生长与活性成分积累的调控211
 第二节 药用植物转基因组织和器官培养的主要技术环节213
 一、农杆菌菌种的保存与培养（包括菌种所含质粒的改造）213
 二、药用植物无菌培养体系的建立214
 三、转化【菌种的活化、外植体的选择、接菌方式（共培养、针刺、
负压等）】214
 四、除菌及筛选215
 五、转化的证实215
 六、转基因组织和器官培养体系的建立215
 七、转基因组织和器官的生长与活性成分积累的调控技术216
 八、摇瓶培养与反应器培养技术216
 第三节 药用植物转基因组织和器官培养的实例217
 一、毛状根培养的实例（紫草）217
 二、冠瘿组织培养的实例（丹参）222
 三、毛状根与冠瘿组织共培养的实例（Duboisia杂交种与颠茄）229
 四、双转化毛状根培养的实例（栝楼）233
 五、绿色毛状根培养的实例（长春花）235
 第四节 转基因药用植物生产疫苗等生物活性成分与基因工程育种238
 一、转基因药用植物生产抗体和疫苗238
 二、基因工程育种及安全性评价246
 主要参考文献251
第八章 人参不定根和毛状根的培养256
 第一节 人参属药用植物组织和细胞培养的研究进展256
 一、愈伤组织的诱导与培养256
 二、试管苗的再生257
 三、细胞悬浮培养258
 四、反应器培养260
 五、毛状根和冠瘿瘤的培养260
 第二节 人参不定根和毛状根培养的材料与方法262
 一、植物材料262
 二、愈伤组织的诱导和增殖262
 三、不定根的诱导和增殖263
 四、毛状根的诱导、鉴别和增殖263
 五、不定根和毛状根的摇瓶培养264
 六、不定根和毛状根的生物反应器培养264
 七、培养基中无机成分的分析264
 八、培养基成分对于不定根和毛状根生长和皂苷含量影响的研究264
 九、物理环境对不定根和毛状根生长以及皂苷生产的影响267
 十、根重量的测定267
 十一、皂苷含量的测定267
 十二、人参多糖的测定268
 十三、可溶性糖和总糖含量的测定268
 第三节 人参不定根培养的实验结果269
 一、愈伤组织和不定根的诱导与增殖269
 二、摇瓶培养中培养基盐浓度对不定根生长和皂苷形成的影响269
 三、植物生长调节剂对不定根生长和皂苷形成的影响270
 四、生物反应器实验中补充培养基对不定根培养的影响270
 五、摇瓶培养时大量元素和金属元素对于不定根生长和皂苷形成的
影响271
 六、摇瓶和反应器中N源对于不定根生长和皂苷合成的影响271
 七、摇瓶培养中碳源和渗透剂对不定根生长和皂苷合成的影响272
 八、生物反应器类型对不定根生长和皂苷合成的影响273
 九、摇瓶和生物反应器两步培养时诱导剂对不定根生长和皂苷合成的
影响273
 十、碳、氮和磷饥饿在两步培养系统中对不定根生长和皂苷合成的
影响274
 十一、白天和黑夜不同温度（DIF）的变化对人参不定根生长和皂苷
合成的影响275
 第四节 人参毛状根培养的实验结果275
 一、摇瓶培养时毛状根生长和皂苷合成的特点275
 二、毛状根培养时培养基成分的变化275
 三、摇瓶培养时培养基的盐浓度对毛状根生长和皂苷合成的影响276
 四、反应器培养时植物生长调节剂对毛状根生长和皂苷合成的影响276
 五、摇瓶和生物反应器培养时碳源对毛状根生长和皂苷合成的影响277
 六、摇瓶培养时渗透压对毛状根生长和皂苷合成的影响277
 七、摇瓶和生物反应器培养时诱导剂对毛状根生长和皂苷合成的
影响277
 八、摇瓶培养时培养基pH值对毛状根生长和皂苷合成的影响278
 九、白天和黑夜不同温度（DIF）的变化对毛状根生长和皂苷合成的
影响278
 十、反应器培养时光照对毛状根生长和皂苷合成的影响279
 主要参考文献279
第九章 药用植物组织培养物的色谱分析282
 第一节 薄层扫描法283
 一、薄层色谱的固定相284
 二、展开剂285
 三、薄层扫描法及其仪器286
 四、薄层扫描定量方法287
 五、分析实例--小蔓长春花组织培养物中长春胺的含量测定288
 第二节 气相色谱与气相-质谱联用技术289
 一、天然产物分析常用的气相色谱289
 二、仪器的基本组成290
 三、色谱柱的类型和选择290
 四、常用检测器291
 五、气相-质谱联用292
 六、在中药和天然产物挥发油分析上的应用294
 第三节 高效液相色谱法294
 一、HPLC的关键部分--色谱柱295
 二、检测器297
 三、分析实例301
 第四节 高效毛细管电泳法303
 一、HPCE的基本原理303
 二、毛细管区带电泳(CZE)303
 三、胶束电动毛细管色谱（MECC) 304
 四、天然有效成分的分析应用304
 五、毛细管柱305
 六、检测方法306
 第五节 样品前处理306
 一、前处理方法的选择307
 二、样品前处理技术308
 主要参考文献311
附录 国内外部分常用药用植物组织培养方法312
 主要参考文献338