CRISPR基因编辑技术

CRISPR-Cas这项技术自问世以来，已经无数次吸引了人们的目光，在短短几年之内，它已经成为生物科学领域最炙手可热的研究工具，并有上千篇相关文献发表。CRISPR-Cas技术的先驱者们，包括珍妮弗·杜德娜（Jennifer Doudna）和艾曼纽·夏邦杰（Emmanuelle Charpentier）两位美女科学家以及华裔科学家张锋，在该领域做出了重要贡献。这里当然还包括提高了Cas9的特异性并发明了CRISPR-Cas碱基编辑技术的顶尖科学家大卫·刘（David R.Liu），他的实验室培养出了许多国内CRISPR-Cas领域的精英。
为了使广大科研工作者尤其是许多没有经验但感兴趣的人更好地了解CRISPR-Cas技术，在化学工业出版社编辑的提议下，经过编者们一年多的辛苦写作和出版者的审校工作，本书成功出版了！全书共15章，系统介绍了CRISPR-Cas技术的发展史、研究进展、结构组成、表观编辑、脱靶效应、脱靶检测方法、实验方案、实验模型和递送系统，以及在微生物学、免疫学、疾病治疗和传染病核酸检测中的应用。
CRISPR-Cas系统，其中CRISPR全称是clustered regularly interspaced short palindromic repeats（簇状规则间隔短回文重复序列），而Cas的全称是CRISPR associated proteins（CRISPR相关蛋白）。CRISPR-Cas系统广泛存在于古菌与细菌中，是原核生物的一种获得性免疫系统（类似于哺乳动物的适应性免疫），通过识别并降解再次入侵的核酸，实现抵抗外来遗传物质（如噬菌体）的入侵。同时，CRISPR-Cas系统由于其精确的靶向功能。已被开发成一种高效的CRISPR-Cas基因编辑工具。在CRISPR-Cas系统中，研究最深入、应用最成熟的是CRISPR-Cas9系统。CRISPR-Cas9是继锌指核酸酶（ZFN）、类转录激活因子效应物核酸酶（TALEN）之后出现的第三代基因组定点编辑技术。
在此感谢各位编者辛勤的付出，是你们在本领域的丰富知识和宝贵经验使得这本书更具阅读价值。本书难免有不妥之处，敬请广大读者批评指正！

刘世利
2020年7月

刘世利，博士毕业于清华大学医学院，后留学于美国华盛顿大学，现为山东大学基础医学院副教授。主要讲授课程和研究方向为医学微生物学。现科研方向主要是人体菌群研究，如细菌种类、细菌基因和细菌引发疾病的机制的研究工作，发表论文34篇。现已出版专著3部，《人体微生物组》、《肿瘤细胞免疫》和《CRISPR基因编辑技术》。参与编写多本大学教材，现从事医学微生物科普著作的创作。

《CRISPR基因编辑技术》由山东大学、北京大学、清华大学、浙江大学、四川大学、温州医科大学、香港中文大学、中国科学院生物物理研究所、中国农业科学院等高校和科研院所的一线专家联合编写，系统介绍CRISPR这一基因编辑技术的发展史、研究进展、结构组成、表观编辑、脱靶效应、脱靶检测方法、实验方案、实验模型和递送系统，以及该技术在微生物学、免疫学、疾病治疗和传染病核酸检测中的应用。全书论述扼要，汇入了不少典型的实验方案，体现了该技术的最新进展及在多个领域的应用，实用性强。
《CRISPR基因编辑技术》可供生命科学、基础医学、药学、农学等领域的研究生和其他研究人员参阅。

第1章　CRISPR-Cas系统概述	001
1.1　引言	002
1.2　CRISPR-Cas分类	003
1.3　2类CRISPR-Cas系统	004
1.4　CRISPR-Cas系统的递送方法	005
1.5　CRISPR-Cas系统的非基因组编辑方法	005
1.5.1　用CRISPR-Cas13和rCas9靶向RNA	005
1.5.2　CRISPRa/CRISPRi、表观遗传修饰和标记	006
1.6　CRISPR-Cas商业化现状	007
1.7　结语	007
参考文献	008

第2章　基因编辑技术史话	011
2.1　引言	012
2.2　基因编辑技术的历史先河：基因打靶技术	012
2.3　昙花一现：锌指核酸酶技术和类转录激活因子效应物核酸酶技术	015
2.4　革命时代的来临：CRISPR技术	018
2.5　结语	021
参考文献	022

第3章　基于CRISPR-Cas系统的基因编辑技术的进展	025
3.1　引言	026
3.2　基因编辑技术的发展	026
3.3　CRISPR-Cas系统的多样性、分类与演变	028
3.3.1　CRISPR-Cas系统分类及作用原理	028
3.3.2　CRISPR-Cas系统的源起和进化	029
3.4　CRISPR-Cas系统的应用进展	031
3.4.1　在细菌及古菌中的应用	031
3.4.2　在真菌中的应用	032
3.4.3　在植物细胞中的应用	033
3.4.4　在动物细胞中的应用	034
3.5　CRISPR-Cas系统的前瞻性应用	035
3.6　结语	037
参考文献	037

第4章　CRISPR-Cas9的结构和作用机制	043
4.1　引言	044
4.2　CRISPR-Cas9生物学	044
4.3　Cas9酶	046
4.3.1　Apo酶的双叶结构	046
4.3.2　HNH和RuvC核酸酶结构域	047
4.4　CRISPR-Cas9效应复合物的组装	047
4.4.1　sgRNA结合后的构象重排	048
4.4.2　Cas9与sgRNA的相互作用	048
4.4.3　预排序种子RNA以及Cas9与PAM的相互作用	049
4.5　目标搜索与识别	049
4.5.1　RNA-DNA异源双链	050
4.5.2　PAM识别	051
4.5.3　局部DNA熔解和R环形成	051
4.5.4　Cas9诱导的DNA弯曲	053
4.6　靶标切割	053
4.6.1　解偶联的DNA结合和切割事件	054
4.6.2　通过HNH-RuvC通讯进行DNA协同切割	054
4.6.3　非靶DNA链在HNH重定位中的关键作用	055
4.7　CRISPR-Cas9介导的DNA靶向和切割模型	056
4.8　Cas9直系同源物的结构	056
4.9　结语	057
参考文献	058

第5章　CRISPR介导的表观遗传学编辑	063
5.1　引言	064
5.2　针对组蛋白的表观修饰	065
5.2.1　转录激活	065
5.2.2　转录抑制	066
5.2.3　目前的局限性	067
5.2.4　克服当前局限性	069
5.3　针对DNA的表观修饰研究	070
5.3.1　DNA甲基化	070
5.3.2　DNA去甲基化	071
5.3.3　使用CRISPR介导的方法探测新的DNA表观遗传修饰	072
5.3.4　m5dC衍生物的氧化	072
5.3.5　N6-甲基脱氧腺苷的发现	072
5.3.6　发现新的DNA表观遗传修饰	073
5.4　针对非编码RNA的表观遗传学功能	074
5.5　化学和光诱导基因组表观编辑	075
5.6　表观基因组编辑与病理和医疗	076
5.7　超越CRISPR-Cas9	077
5.8　结语	078
参考文献	080

第6章　CRISPR-Cas9的脱靶效应	089
6.1　引言	090
6.2　最小化CRISPR-Cas9系统脱靶效应的策略	091
6.2.1　改善sgRNA-Cas9复合物的有效浓度和sgRNA-Cas9复合物递送	091
6.2.2　sgRNA分子的合理设计	093
6.2.3　新的Cas9变体的合理工程设计	094
6.2.4　Cas9直系同源物	095
6.2.5　Ⅱ类Cas9直系同源物	096
6.3　CRISPR-Cas9系统中脱靶效应的检测方法	098
6.3.1　预测的脱靶位点检测	099
6.3.2　WGS	099
6.3.3　ChIP-seq	099
6.3.4　IDLV捕获	100
6.3.5　BLESS	100
6.3.6　GUIDE-seq	101
6.3.7　LAM-HTGTS	101
6.3.8　Digenome-seq	102
6.3.9　SITE-seq	102
6.3.10　CIRCLE-seq	103
6.3.11　GOTI	103
6.3.12　PEM-seq	104
6.3.13　DISCOVER-seq	104
6.4　结语	105
参考文献	105

第7章　CRISPR-Cas9的实验模型	112
7.1　引言	113
7.2　细胞模型	114
7.3　动物模型	118
7.3.1　鼠	118
7.3.2　果蝇	120
7.3.3　斑马鱼	121
7.3.4　猪	123
7.3.5　其他动物模型	123
7.4　植物	125
7.5　真菌	127
7.6　细菌	129
7.7　结语	133
参考文献	133

第8章　纳米材料递送CRISPR-Cas系统	136
8.1　引言	137
8.2　纳米材料概述	137
8.2.1　纳米材料定义及特性	137
8.2.2　纳米材料的分类	138
8.2.3　纳米材料的应用	138
8.3　基因疗法简介	139
8.4　纳米材料递载CRISPR-Cas系统的生物应用	140
8.4.1　二维纳米材料递送CRISPR-Cas系统的生物应用	140
8.4.2　贵金属及自组装纳米材料递载CRISPR-Cas系统的生物应用	143
8.4.3　其他纳米材料递载CRISPR-Cas系统的生物应用	145
8.5　结语	146
参考文献	147

第9章　全基因组CRISPR-Cas9基因敲除和转录激活筛选的实验方案	149
9.1　引言	150
9.2　实验设计	151
9.2.1　筛选方法	151
9.2.2　sgRNA文库的设计和选择	151
9.2.3　构建和递送sgRNA文库的方法	152
9.2.4　选择sgRNA	153
9.3　材料	155
9.3.1　试剂	155
9.3.2　耗材及设备	160
9.3.3　试剂制备	162
9.3.4　材料准备	164
9.3.5　步骤	164
9.4　结语	189
参考文献	189

第10章　细菌中的CRISPR-Cas系统及其功能	191
10.1　引言	192
10.2　细菌中CRISPR的分布	193
10.3　CRISPR-Cas系统在细菌研究中的应用	194
10.3.1　对细菌基因组进行编辑	194
10.3.2　参与细菌基因的表达调控	195
10.3.3　与细菌生物膜、毒力和细菌耐药的关系	196
10.3.4　参与细菌与宿主的相互作用	196
10.3.5　与细菌分型的关系	197
10.3.6　基于CRISPR系统的细菌进化分析	198
10.3.7　与核酸检测的关系	198
10.4　CRISPR-Cas系统的应用可能带来的伦理问题及有害影响	200
10.5　结语	201
参考文献	201

第11章　CRISPR-Cas技术在抵抗病原微生物感染中的应用	206
11.1　引言	207
11.2　CRISPR-Cas9基因编辑系统在病毒相关疾病治疗中的应用	207
11.3　CRISPR-Cas9基因编辑系统在细菌和真菌中的应用	208
11.4　结语	209
参考文献	209

第12章　CRISPR-Cas9在免疫学研究中的应用	211
12.1　引言	212
12.2　CRISPR-Cas9在免疫相关疾病发病机制研究中的应用	212
12.2.1　造血系统恶性肿瘤疾病机制及动物模型研究	212
12.2.2　CRISPR-Cas9全基因组筛选用于研究复杂生命过程	213
12.3　CRISPR-Cas9在免疫相关疾病治疗中的应用	214
12.3.1　肿瘤免疫治疗	214
12.3.2　治疗HIV感染	215
12.4　结语	217
参考文献	218

第13章　CRISPR-Cas系统在核酸检测中的应用	220
13.1　引言	221
13.2　基于CRISPR-Cas系统的核酸检测分类	222
13.2.1　基于Cas9系统的核酸检测	222
13.2.2　基于CRISPR-Cas12和Cas14系统的DNA检测	223
13.2.3　基于CRISPR-Cas13系统的RNA检测	225
13.3　CRISPR-Cas核酸检测系统的优势及局限性	227
13.4　结语	227
参考文献	228

第14章　CRISPR-Cas9在疾病治疗中的应用	229
14.1　引言	230
14.2　CRISPR-Cas9系统在癌症生物学中的潜在应用	230
14.3　CRISPR-Cas9在遗传性疾病中的作用	231
14.4　CRISPR-Cas9在病毒性疾病中的作用	232
14.5　CRISPR-Cas9在神经系统疾病中的作用	234
14.6　CRISPR-Cas9在过敏和免疫疾病中的作用	234
14.7　结语	235
参考文献	236

第15章　CRISPR-Cas在传染病检测和治疗中的应用	237
15.1　引言	238
15.2　CRISPR-Cas生物学	238
15.2.1　获取间隔序列	239
15.2.2　crRNA生成	239
15.2.3　干扰	240
15.3　CRISPR-Cas9技术概述	242
15.3.1　CRISPR-Cas9基因工程	242
15.3.2　sgRNA文库用于筛选基因型-表型	242
15.3.3　使用失活的Cas9调节基因转录	242
15.4　在传染病中的应用	243
15.4.1　了解宿主与病原体的相互作用	243
15.4.2　在传染病诊断中的应用	244
15.4.3　CRISPR-Cas在治疗中的应用	246
15.5　结语	249
参考文献	251