实用生物技术丛书--植物细胞培养技术与应用

植物细胞培养是20世纪80年代以后迅速发展起来的技术。已成为生物技术研究开发的新热点。
植物是各种色素、药物、香精和酶等天然产物的主要来源。目前已知的天然化合物超过30 000种，其中80%以上来自于植物；从植物中得到的最普遍又必不可缺的药物有17类，我国普遍使用的中药及其制剂80%以上来源于植物，美国使用的植物来源的药物每年超过35亿美元；天然食用色素、天然染料和天然香料绝大部分来源于植物；全世界每年使用的植物来源的芳香化合物的价值超过20亿美元。由此可见，植物来源的物质与人们的生活和身体健康有着极其密切的关系。
迄今为止， 植物来源的物质的生产大多数采用提取分离法。即首先采集植物（栽培的或野生的），然后采用各种生化技术，将有用的物质从植物组织、器官中提取出来，再进行分离纯化，得到所需物质。例如, 从红豆杉中分离紫杉醇；丛鼠尾草中提取分离迷迭香酸；从紫草根中提取分离紫草宁；从玫瑰茄中提取分离花青素；从木瓜果中提取木瓜蛋白酶和木瓜凝乳蛋白酶；从人参中提取分离人参皂苷；从茉莉花中提取分离茉莉香精等。
提取分离法设备简单，但是受到原料来源的限制。由于植物的栽培和生长受到地理环境和气候条件等的影响，难于满足人们的需要。尤其是我国人多地少，野生植物资源不足， 栽培条件又受到各种限制， 不少植物来源的天然产物出现供不应求的情况， 并呈现出越来越严重的趋势。为此，发展植物细胞培养技术，生产各种植物来源的有重要应用价值的天然产物，具有深远的意义和广阔的应用前景。
植物细胞培养的概念是20世纪初产生的，1902年，哈勃兰德（Haberlandt）提出了植物细胞全能性概念，认为植物细胞具有再生成为完整植株的潜在全能性，首次提出分离植物单细胞并将其培养成植株的设想。1943年，怀特（White）正式提出植物细胞全能性理论，认为每个植物细胞具有母株植物的全套遗传信息，具有发育成完整植株的能力。并且进行了番茄根培养研究，通过根尖培养获得了无性繁殖系。1954年，缪尔（Muir）首次成功地进行了植物细胞的悬浮培养。100年来, 随着培养基的研制和培养技术的发展,已经从400多种植物中分离出细胞，不仅可以通过细胞的再分化生成完整的植株， 而且可以通过细胞培养，获得600多种人们所需的各种物质。植物细胞培养已经建立起专门技术，形成新的学科体系。
植物细胞可以直接从植物组织、器官中通过机械切割、组织破碎或酶解方法获取，也可以通过诱导愈伤组织，再经过分散、筛选而获得，还可以通过分离原生质体，然后经过细胞壁再生的方法获得。现在国内外大多数采用诱导愈伤组织的方法获取各种所需的植物细胞。
通过上述方法获取的植物细胞往往未能满足人们的需要，必须经过筛选、诱变、原生质体融合或者基因重组等技术进行植物细胞的选育与改良，以获得符合人们要求的优良的植物细胞。
植物细胞培养方法多种多样。按照培养方式的不同，可以分为固体培养、液体静止培养和液体悬浮培养等；按照培养对象的不同，主要分为愈伤组织培养、单细胞培养、原生质体培养、固定化细胞培养、小细胞团培养等。各种培养方法的培养对象、培养目的和培养方式有所不同，要根据具体情况进行选择和使用。在培养过程中要设计或选择性能好、效率高的植物细胞反应器，设计和配制适宜的培养基，根据植物细胞的特性采用有利于细胞生长和次级代谢物产生的培养方式，控制好各种培养条件，进行培养条件优化，并根据变化情况进行适当的调节控制，以使植物细胞快速、健康、稳定地生长和进行新陈代谢。
植物细胞可以在人工控制条件的生物反应器中进行细胞悬浮培养，以生产人们所需色素、药物、香精、酶、多肽等次级代谢产物。
与从植物中提取分离这些物质相比，植物细胞悬浮培养生产次级代谢物具有提高产率、缩短周期、提高产品质量等显著特点，而且不占用耕地，不受地理环境和气候条件等的影响，对于农业产品的工业化生产具有深远的意义。
植物细胞培养在工业上的另一个重要应用是利用植物细胞进行生物转化。即通过植物细胞内生成和积累的各种酶的催化作用，将外源底物转化为药物、食品添加剂等具有较高应用价值的产物。
植物细胞生物转化具有转化率高、选择性强、副产物少等显著特点，在各种所需化合物的生产，特别是在药物的生产方面越来越受到关注。
植物细胞培养在农业方面主要用于种质保存、人工种子制备和植物的大规模快速繁殖。
植物种质的保存传统上是利用植物种子进行长期保存的，由于自然灾害、生物竞争等因素，使不少植物品种已经或正在消失；对于无性繁殖的植物，由于没有可供保存的种子，只能在田间种植保存，不仅占用耕地、费时费力，而且可能由于环境、气候、生产管理等方面因素的影响，而造成种质资源的丢失。采用植物细胞继代培养或者冷冻保存的方法进行种质保存，不仅简单方便，而且可以使植物的遗传特性得以长期稳定地保存。对于稀有植物品种、优良植物品种和新型植物品种的种质保存具有重要的意义。
人工种子是指经过多孔凝胶等载体包埋固定化的植物胚状体。胚状体可以经过愈伤组织诱导和细胞悬浮培养而获得。1958年斯特瓦德（Steward）首次成功地利用胡萝卜胚状体发育成完整的植株，此后，人工种子的研制和开发快速发展。人工种子的制备与植物常规种子的生产相比，具有不占用耕地，不受地理、气候等条件的影响，可以快速、大量地进行工业化生产，生产效率高，种质长期稳定等显著特点。对于优良品种和新型品种的迅速大规模扩大生产具有重要的意义和广阔的应用前景。
传统的植物繁殖是在田间或在温室中进行有性或无性繁殖，效率低，时间长，不利于优良品种和新品种的大规模推广应用。采用植物细胞培养技术，首先获得愈伤组织和植物细胞，然后在一定条件下进行培养，使植物细胞分化为植株。可以快速、高效地进行植物的繁殖，并且不受地理环境和气候条件的影响，还可以结合基因转移、原生质体融合等技术获得具有优良特性的植物新品种。植物快速繁殖技术已经在实际生产中得到广泛应用。
几十年来，特别是近20多年来，植物细胞培养技术及其在工业、农业等领域的应用发展迅速，已经取得不少令人瞩目的成果。
在21世纪，随着科技的发展，植物细胞培养及其应用技术将进一步发展到前所未有的水平，为人类的健康长寿和经济、社会的发展做出贡献。
本书的编写宗旨是以实用技术为特色，以植物细胞培养在医药、食品、轻工、化工、农业等领域的应用为主线，理论与实际紧密结合，推动植物细胞培养技术的发展和产业化的进程。
本书的前言、第一章、第四章、第五章由郭勇编写，第二章、第三章、第七章由崔堂兵编写，第六章由谢秀祯编写。
本书可供在医药、食品、轻工、化工、农业等领域从事植物细胞培养的研究、开发、生产与应用的科学工作者、工程技术人员、生产工作者以及高等院校生物工程、生物技术、生物科学、细胞工程、发酵工程、农学、植物资源与环境、食品科学与工程等有关专业的师生使用。
本书的出版，得到华南理工大学、化学工业出版社和国内外许多专家、学者的指导和帮助，在此表示衷心的感谢。
由于植物细胞培养技术发展很快, 新的技术和方法不断涌现，加上编者水平所限， 不当之处， 诚请读者指正。

编著者
2003年8月

本书是《实用生物技术丛书》的组成部分。主要介绍植物细胞培养的基本理论、基本技术及其在工业上用于生产次级代谢物和进行生物转化，在农业上用于种质保存、人工种子制备、植物的快速繁殖等方面的最新研究进展及发展趋势。内容包括绪论、植物细胞的获取、植物细胞的选育与改良、植物细胞培养方法、植物细胞培养生产次级代谢物、植物细胞在生物转化方面的应用、植物细胞培养在农业方面的应用等七章。

第一章绪论1
第一节植物细胞培养的基本概念1
一、细胞2
二、细胞生长与细胞周期2
三、细胞分裂4
四、细胞分化与脱分化6
五、植物组织培养7
六、植物细胞培养7
第二节植物细胞培养的发展概况8
一、基础理论发展阶段8
二、基本技术发展阶段9
三、应用研究发展阶段10
第三节植物细胞培养的应用前景11
第二章植物细胞的获取14
第一节外植体的选择与预处理14
一、外植体的选择14
二、外植体的预处理16
第二节从外植体直接分离植物细胞20
一、机械捣碎法20
二、酶解法20
第三节通过愈伤组织诱导获取植物细胞21
一、影响愈伤组织诱导的因素21
二、愈伤组织的形成过程23
三、愈伤组织的生长增殖过程24
四、从愈伤组织分离得到植物细胞25
第四节通过原生质体再生获取植物细胞25
一、植物细胞原生质体的分离25
二、原生质体再生形成植物细胞32
第三章植物细胞的选育与改良33
第一节植物细胞的筛选33
一、细胞筛选的方法34
二、影响细胞筛选效果的因素36
第二节植物细胞的诱变38
一、诱变剂38
二、诱变的基本过程39
三、突变细胞的主要类型和选择实例40
第三节植物原生质体融合51
一、植物原生质体融合的意义52
二、植物原生质体融合的方法53
三、植物原生质体融合的基本过程58
四、植物原生质体融合实例67
第四节植物细胞的基因重组与转移68
一、植物细胞基因转移的方法69
二、转基因植物细胞的筛选与检测72
三、植物细胞基因重组与转移的应用76
第四章植物细胞培养方法90
第一节植物细胞的特性与培养方法90
一、植物细胞的特性90
二、植物细胞的培养方法91
第二节植物细胞培养基92
一、植物细胞培养基的基本成分92
二、植物细胞培养基的特点94
三、几种常用的植物细胞培养基95
四、植物细胞培养基的配制96
第三节愈伤组织培养98
一、愈伤组织培养的基本过程98
二、愈伤组织培养的条件99
三、愈伤组织培养的应用99
第四节单细胞培养100
一、植物单细胞的获得101
二、植物单细胞的培养方法101
三、植物单细胞培养的条件105
第五节单倍体细胞培养105
一、植物单倍体细胞的获得106
二、植物单倍体细胞的培养方法106
三、植物单倍体细胞培养的应用107
第六节原生质体培养108
一、植物原生质体的特点108
二、植物原生质体的制备108
三、植物原生质体的培养方法109
四、植物原生质体培养的应用111
第七节固定化细胞培养112
一、植物细胞固定化的方法112
二、固定化植物细胞的特点113
三、固定化植物细胞的培养方法114
四、固定化植物细胞培养的应用114
第八节小细胞团培养115
一、植物小细胞团的形成与控制115
二、植物小细胞团的同步化方法116
三、植物小细胞团的培养方法117
四、植物小细胞团培养的应用117
第五章植物细胞培养生产次级代谢产物119
第一节植物细胞次级代谢产物的生物合成途径119
一、次级代谢物生物合成的基本途径120
二、生物碱的生物合成123
三、香豆素的生物合成126
四、类黄酮的生物合成128
五、蒽醌类化合物的生物合成130
六、萜类和甾体的生物合成131
七、蛋白质的生物合成133
第二节植物细胞培养生产次级代谢物的工艺过程及其影响因素135
一、植物细胞培养生产次级代谢物的工艺过程135
二、培养基对细胞生长和次级代谢物生产的影响139
三、温度对细胞生长和次级代谢物生产的影响141
四、pH值对细胞生长和次级代谢物生产的影响141
五、溶解氧对细胞生长和次级代谢物生产的影响142
六、光照对细胞生长和次级代谢物生产的影响143
第三节植物细胞培养动力学144
一、细胞生长动力学144
二、产物积累动力学145
三、基质消耗动力学146
第四节植物细胞次级代谢物生物合成的调节146
一、前体的调节147
二、刺激剂的调节147
三、基因的调节147
四、酶活性的调节148
五、细胞透过性的调节149
第五节植物细胞次级代谢物的提取与分离纯化149
一、细胞破碎149
二、次级代谢物的提取152
三、沉淀分离154
四、层析分离156
五、萃取分离165
六、结晶168
七、浓缩与干燥170
第六节植物细胞生物反应器171
一、机械搅拌式反应器171
二、气升式反应器172
三、鼓泡式反应器172
四、填充床式反应器172
五、流化床反应器173
六、膜反应器174
第六章植物细胞培养在生物转化方面的应用175
第一节植物细胞生物转化发展概况175
一、生物转化的基本概念175
二、生物转化的发展沿革175
三、生物转化的特点176
第二节植物细胞生物转化的主要反应类型177
一、羟基化反应177
二、糖基化反应178
三、氧化还原反应178
四、水解反应179
第三节植物细胞生物转化系统179
一、悬浮细胞转化系统179
二、固定化细胞转化系统180
三、 固定化原生质体转化系统180
四、发状根转化系统181
第四节影响植物细胞生物转化的因素182
一、 植物细胞的影响182
二、外源底物的影响183
三、培养条件的影响184
第五节植物细胞生物转化的应用185
一、在药物合成方面的应用185
二、在食品添加剂合成方面的应用190
第七章植物细胞培养技术在农业方面的应用194
第一节植物种质的保存194
一、继代培养保存195
二、 限制生长保存195
三、 超低温保存197
四、 植物种质保存实例202
第二节人工种子的制备203
一、人工种子的概念及结构特点203
二、人工种子制备的意义204
三、人工种子的制备过程204
四、 人工种子制备中存在的问题及展望210
五、 人工种子制备实例211
第三节植物的快速繁殖211
一、植物细胞的全能性与细胞的分化212
二、植物快速繁殖的意义213
三、植物快速繁殖的类型213
四、 植物快速繁殖的方法214
五、植物快速繁殖实例221
参考文献223